Polymerase-Chain-Reaction (PCR)

Die Einführung der PCR ist ein Meilenstein in der Entwicklung der molekularen Genetik. Durch ihren Einsatz, ist es gelungen die nur in geringen Mengen vorkommende DNA so weit anzureichern, das sie für weiterführende Untersuchungen in ausreichendem Maße zu Verfügung stand.

Die schnell fortschreitende Entwicklung dieser Methode führte dazu, das heutzutage selbst ein einziger DNA-Strang (oder auch nur Fragmente davon) ausreicht ihn mit Hilfe der PCR zu "vermehren".
Sogar die sehr kurzlebige RNA kann mit speziellen Methoden angereichert (amplifiziert) werden.

Die Methodik, die der PCR zu Grunde liegt, hat ihr Vorbild in der Natur gefunden. Sie benutzt die Biologie von sehr exotischen Organismen, die in heißen Quellen in den Tiefen des Ozeans leben.
Diese Organismen, gehören zu den wenigen Lebewesen auf dieser Erde, die unabhängig vom Sonnenlicht existieren können. Sie beziehen ihre Lebensenergie aus nicht vollständig oxidierten Mineralien, die aus den heißen Quellen austreten. Diese Mineralien strömen als dunkle Wolke aus den heißen Quellen in das sie umgebende kalte Tiefenwasser des Meeres. Aus diesem Grund werden diese Quellen auch als "black smoker" oder "deep vent" bezeichnet.
Aufgrund dieser sehr "annormalen" Umgebung, haben die dort lebenden Organismen Überlebensstrategien entwickelt, die so kein anderer aufweist.
Eines dieser "Phänomene" ist die Entwicklung von Polymerasen, die die extreme Hitze innerhalb der Quelle widerstehen können. "Normale" Polymerasen würden ab ca. 40°C denaturieren (verklumpen), die Polymerasen der "deep vent" Bewohner behalten selbst bei Temperaturen von 100°C ihre 3-D-Struktur, können also ihre enzymatische Funktion weiterhin ausüben. Diese Polymerasen werden deswegen als thermostabil bezeichnet.

Eine weitere Grundlage der PCR ist die Tatsache, daß DNA bei Temperaturen über 60°C ihre Doppelhelix-Struktur verliert und als Einzelstrang vorliegt, man nennt diesen Vorgang "Schmelzen" der DNA. Durch geschicktes manipulieren der Temperatur kann man zwischen Bereichen hin und her springen, in denen die DNA als Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegt.

Wenn diese beiden natürlichen Vorkommnisse kombiniert werden, ist der Funktions-Rahmen der PCR bereits abgesteckt. Durch den Einsatz thermostabiler Polymerasen und geschicktes wechseln der Temperaturen im Versuchsansatz, wird ein System etabliert, das wie von selbst DNA exponentiell vervielfälltigt.

Dieses simple Schema gibt einen vereinfachten Ablauf einer PCR wieder.
Die "Grund-Mixtur" (Ansatz) enthält eine thermostabile Polymerase, die vier Desoxynukleotide (ATP, CTP, GTP, TTP), einen Primer in hoher Konzentration, der komplementär zu einem Teilstück der zu untersuchenden DNA ist, und die eigentliche DNA (häufig "Template" genannt).
Dieser Mix wird zuerst auf 96°C erhitzt, damit gewährleistet ist, das alle DNA-Bereiche einzelsträngig vorliegen.
Annealing:
Darauf erfolgt ein schnelles Runterkühlen auf ca. 50°C. Jetzt kann sich der komplementäre Primer an die passende Stelle der DNA anlagern (annealen). Der ca. 25 Basenpaare große Primer lagert sich sehr schnell an die entsprechende Stelle an, so das in späteren Zyklen bereits angereicherte DNA (die wesentlich größer ist) keine Möglichkeit findet den Primer zu verdrängen.
Polymerisation:
Die Temperaturerhöhung auf 72°C bringt die thermostabile Polymerase auf ihr Temperaturoptimum. Sie kann nun den an der DNA haftenden Primer verlängern, indem sie Desoxynukleotide komplementär zum Template einbaut. Das Ende der DNA ist nach kurzer Zeit erreicht und hier stoppt die Polymerisation.
Denaturierung:
Ein erneutes Aufkochen auf 96°C trennt nun die entstandene DNA-Doppelhelix wieder in zwei Einzelstränge, von denen der eine wieder als Vorlage für eine erneute Runde der Polymerisation zur Verfügung steht.

Diese Polymerase-Ketten-Reaktion kann 20 - 50 Zyklen umfassen, ganz nach verwendeter Polymerase, Temperatur oder Template-Länge. In jedem Fall erfolgt eine exponentielle Vermehrung der DNA, wenn (anders als im obigen Schema) zwei Primer verwendet werden, die jeweils den anzureichernden Bereich flankieren. Der eine den 5'-3'-Bereich, der andere den 3'-5'-Bereich.

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